ELISA實驗操作要點：ELISA檢測需做好那幾步

　　ELISA檢測系統可謂是免疫學反應應用到科研生產中最為廣泛最為靈敏的技術手段。可是在新老手操作過程中總是會出現或大或小的問題，比如說花板，假陽性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低.。

　　1、包被原的性質很重要，蛋白濃度，是否降解，這關系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對于生物素和脂類物質或小分子物質我們要事先對其改造再加以包被，方法簡要的列出如下:

　　①親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。

　　②脂類物質:可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發后，讓脂質自然干固在固相表面。

　　③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯后才能固定在固相載體上。

　　2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。應注意以下原理：由于蛋白質與聚苯乙/烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下最終可不可以應用到自己試驗當中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

　　3、封閉：繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。但最終選用什么，要依據試驗具體來實踐。

　　4、洗滌板：可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。因為聚苯乙/烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，為達到分離游離的和結合的酶標記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的干擾物質，在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。所以在洗板時會有一定誤差，人為因素很大(當然有條件的用洗板機除外)，洗的不或串了孔，對如此靈敏的ELISA系統可是不小的影響。

　　5、加抗體標本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋一般可用PBS稀釋，也可用封閉液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費，太低則著色淺。

　　6、顯色：顯色系統又很多，我們一開始做的時候，要選擇適宜的顯色系統。注意顯色系統酶活性底物的保存HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉。

　　7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如出現問題也好分析。

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